Ana Bolena era hija de sir Thomas Boleyn, que la llevó a Francia en 1519 para que se desenvolviera en la corte como dama de honor de la reina Claudia. Cuando regresó a Gran Bretaña, fue dama de honor de Catalina de Aragón, esposa de Enrique VIII. Llegó a inspirar tal pasión en el monarca que se divorció de Catalina para estar con Ana.

El 25 de enero de 1532 contrajeron matrimonio en secreto, y en mayo el arzobispo Cranmer declaró nulo el matrimonio con Catalina y legitimó la unión con Ana Bolena. Los amores entre Ana Bolena y Enrique VIII, y el consiguiente divorcio de Catalina de Aragón, fueron la causa directa del cisma de Inglaterra.

En junio de 1533 fue coronada como la legítima reina de Inglaterra. Con el tiempo, Ana se quedó embarazada, pero el Rey quería tener un hijo varón y se decepcionó cuando nació su hija, a la que llamaron Isabel. Esta niña se convertiría posteriormente en Isabel I, reina de Inglaterra y única heredera de Enrique.

En enero de 1536, Ana dio a luz a un niño muerto el mismo día en que Catalina de Aragón falleció. Esta circunstancia unida al mal carácter de Ana y a que el Rey ya se había encaprichado con Jane Symour, dama de honor de Ana, hicieron que la reina perdiera el favor de Enrique. Tras la noticia de la muerte de Catalina, se dice que Enrique y Ana se engalanaron con ropas de color amarillo brillante. Algunos historiadores lo han interpretado como demostraciones públicas de alegría en cuanto a la muerte de Catalina, pero es dudoso que la pareja real hubiera celebrado en público la muerte de Catalina, puesto que Enrique la consideraba como la «Princesa viuda de Gales», la viuda de su hermano el príncipe Arturo.

Circularon rumores de que Catalina había sido envenenada (culpaban tanto a Ana como a Enrique); los rumores surgieron tras descubrir durante su embalsamamiento que su corazón estaba ennegrecido. Los expertos médicos modernos están de acuerdo en que la oscuridad del corazón de Catalina no era debida al envenenamiento, sino al cáncer de corazón, algo que no se conocía por entonces.​ Tras la muerte de Catalina, Ana intentó mejorar sus relaciones con la hija de Catalina, María, pero fue rechazada de nuevo.

Durante el día del entierro de Catalina, el 29 de enero de 1536, Ana sufrió un aborto. Para la mayor parte de observadores, esta pérdida personal fue el principio del fin del matrimonio real. Lo que pasó después es uno de los períodos más polémicos de la historia inglesa, dado que es tanto una tragedia personal como un indicativo de las tendencias políticas más extensas que gobernaron la Casa de Tudor en ese período.

Cuando Ana se repuso de su aborto, Enrique declaró que su matrimonio había sido maldecido por Dios. Juana Seymour fue trasladada a nuevas dependencias y el hermano de Ana no fue aceptado en una prestigiosa orden de caballería, la Orden de la Liga, que en cambio le fue otorgada al hermano de Juana Seymour. En varias ocasiones a lo largo de estos meses, Ana expresó su temor ante la posibilidad de un próximo divorcio.

En los últimos días de abril, un músico flamenco al servicio de Ana llamado Mark Smeaton fue detenido y torturado por Thomas Cromwell. Al principio negó que él fuera el amante de la reina, pero bajo tortura confesó. También proporcionó el nombre de otro cortesano, Henry Norris, un viejo amigo tanto de Ana como del rey. Norris fue detenido durante el May Day (1 de mayo), pero dado que era un aristócrata no podía ser torturado. Él negó su culpabilidad y juró que Bolena era también inocente. Francis Weston fue detenido dos días más tarde bajo el mismo cargo. También detuvieron a William Brereton, un mozo de la cámara privada del rey, que también fue arrestado por adulterio, pero realmente parece probable que fue víctima de un viejo rencor contra él, sostenido por Thomas Cromwell. El acusado final fue Jorge Bolena, el propio hermano de la reina Ana, detenido bajo acusación de incesto y traición, acusado de mantener relaciones sexuales con su hermana durante los últimos doce meses.

El 2 de mayo de 1536, tras asistir a un partido de tenis, Ana fue detenida y llevada a la Torre de Londres.​ Allí sufrió una crisis nerviosa menor, exigiendo saber todos los detalles sobre el paradero de su familia y los cargos contra ella.

Cuatro de los hombres fueron procesados en Westminster el 12 de mayo de 1536. Weston, Brereton y Norris mantuvieron públicamente su inocencia y solo el torturado Smeaton apoyó a la Corona declarándose culpable. Tres días más tarde, Ana y Jorge fueron procesados por separado en la Torre de Londres. Ella fue acusada de adulterio, incesto y alta traición. La sospecha popular contra Enrique y su amante, Juana Seymour, los cuales fueron vistos de banquete en el Támesis, era generalizada. Varios panfletos circularon por Londres burlándose de los procesos y apoyando a la reina.

Vinieron por Ana durante la mañana del 19 de mayo para llevarla a la Torre Verde, donde debía permitírsele la dignidad de una ejecución privada.

El gobierno no aprobó proporcionar un ataúd apropiado para Ana. Tras la decapitación, su cuerpo y su cabeza fueron depositados en un arca alargada y sepultados en una tumba sin marcar en la capilla de San Pedro ad Vincula. Su hija, la reina Isabel I, a su llegada al trono nunca se preocupó de rehabilitar su memoria y buscar un lugar más digno para que los restos de su madre descansaran. En 1876 su cuerpo fue identificado en unas reformas de la capilla bajo el reinado de la reina Victoria y de esta manera el lugar de descanso de los restos mortales de Ana está marcado ahora en el suelo de mármol.